Малекулярна-генетычны метад даследавання

Для вывучэння і выяўлення варыянтаў ў структуры ДНК ўжываецца малекулярна-генетычны метад. Для кожнага ўчастка ДНК, які даследуецца, рэгіён гэта храмасомы, ген або алеляў, метады адрозніваюцца. У аснове кожны малекулярна-генетычны метад змяшчае тыя ці іншыя маніпуляцыі з РНК і ДНК. Усе дадзеныя метады адрозніваюцца велізарнай складанасцю, без лабараторных умоў праводзіцца не могуць, і персанал павінен быць высокакваліфікаваны. Праводзіцца гэтая праца ў некалькі этапаў.

этапы

Спачатку ўзоры РНК або ДНК трэба атрымаць. Тут малекулярна-генетычны метад можа прымяняцца ў адносінах да практычна любому матэрыяле: кропля крыві, лейкацыты, культура фибропластов, слізістая абалонка (соскоб), нават валасяныя цыбуліны, - ДНК можна атрымаць з любога ўзору. Яна прыдатная для таго, каб прымяніць любы малекулярна-генетычны метад і розныя іх варыянты, а ўжо выдзеленая ДНК доўга захоўваецца ў замарозцы. Другі этап прысвечаны назапашвання патрэбных фрагментаў (амплификации) ДНК, забяспечыць ж яго дапамагае ланцуговая палімеразную рэакцыя in vitro (у прабірцы, без удзелу жывога арганізма). У выніку абраны фрагмент ДНК размножваецца з дапамогай гэтай ланцуговай рэакцыі, і колькасць ДНК ўзрастае літаральна ў мільён разоў.

Трэцім этапам малекулярна-генетычных метадаў даследавання мяркуецца рэстрыкцыяў размнажэнне ДНК (гэта фрагментаванасць, раздзіранне або разразанне). Рэстрыкцыяў праводзіцца з дапамогай электрафарэзу на полиакриламидном або агарозном гелі. Гэты малекулярна-генетычны метад вывучэння ДНК дазваляе кожнаму фрагменту заняць у гелі пэўнае становішча. Пасля гэтага гель апрацоўваецца этидием браміду, здольным звязвацца ў ДНК, праводзіцца апрамяненне ўльтрафіялетам, пасля чаго можна назіраць ўчасткі святлення. Малекулярна-генетычныя метады дыягностыкі разнастайныя і шматлікія, аднак першыя два этапы характэрныя для ўсіх. А вось для таго, каб выявіць фрагменты ДНК, гель можна афарбоўваць і многімі іншымі існуючымі спосабамі.

разнавіднасці

Да самых прамым і распаўсюджаным спосабам выяўлення мікабактэрый можна аднесці вышэйапісаны малекулярна-генетычны метад вывучэння ДНК. Сутнасць яго складаецца ў тым, каб выявіць ў дыягнастычным матэрыяле спецыфічныя фрагменты ланцужкі ДНК-узбуджальнікаў. Малекулярна-генетычныя метады дыягностыкі пакуль не маюць больш эфектыўнага спосабу распазнаваць такое захворванне, як сухоты. Ужываючы палімеразную ланцуговую рэакцыю (ПЦР), можна быць упэўненым, што зыходная ДНК павялічыць колькасць копій у мільён разоў, гэта значыць адбудзецца амплификация, і гэта дазволіць візуалізаваць вынікі. Узровень адчувальнасці тут вельмі высокі - больш за дзевяноста пяці адсоткаў, што і з'яўляецца галоўнай вартасцю дадзенага метаду.

Астатнія малекулярна-генетычныя метады даследаванні па эфектыўнасці саступаюць шматразовага капіяванню літаральна ўдвая, паколькі ў гэтым выпадку рэдакцыйная проба паказвае спецыфічную олигонуклеотидную паслядоўнасць узрослай у сто шэсць разоў. Нават культуральный дыягностыка сухотаў органаў дыхання значна ніжэйшы ў сваёй адчувальнасці. Менавіта таму сучасная медыцына абапіраецца на малекулярна-генетычныя метады дыягностыкі туберкулёзу. А апісаны метад асабліва эфектыўны пры сустрэчы з ўзбуджальнікамі высокай антыгеннай зменлівасці, вызначыць якія іншым спосабам значна больш складана - патрабуюцца асаблівыя пажыўныя асяроддзя і доўгі час культывавання. Біяхімічны і малекулярна-генетычны метады даюць зусім розныя па эфекту вынікі.

дыягностыка сухотаў

Выбудоўваюць ПЦР-дыягностыку сухотаў найбольш часта з выкарыстаннем тых паслядоўнасцяў ДНК, якія спецыфічныя для ўсіх чатырох відаў гэтага захворвання. Для дасягнення пастаўленай мэты часцей за ўсё выкарыстоўваюць праймер, што выяўляюць паслядоўнасці IS элементаў (IS-986, IS-6110), бо гэтыя мігруючыя элементы характарызуюць асабліва віды мікабактэрый туберкулёзу і заўсёды прысутнічаюць некалькімі копіямі ў геноме. Таксама выдзяленне ДНК можна ажыццявіць з чыстых культур і клінічных (мокрота хворых) любым іншым прымальным метадам. Напрыклад, ёсць метад Boom, дзе выкарыстоўваецца лизирующий буфер на аснове гуанидина, двухвокісу крэмнію і тиоционата як носьбіта ДНК. Колькасць хворых, якія адрозніваюцца бедным бактэрыявыдзяленнем, з кожным годам павялічваецца, і таму ў клінічнай практыцы зацвердзіўся зусім іншы ўзровень арганізацыі: малекулярна-генетычны метад вывучэння ДНК гуляе ўжо галоўную ролю ў дыягностыцы.

Аднак трэба прызнаць, што і ён не без недахопаў. Прымяненне ПЦР-метаду часта прыносіць велізарнае колькасць прытворнададатных вынікаў, і віной тут не толькі тэхнічныя хібы, але і асаблівасці самога метаду. Акрамя ўсяго іншага, з дапамогай дадзенага спосабу дыягностыкі вызначыць ступень жыццяздольнасці мікабактэрый, якія выяўлены, проста немагчыма. Але і гэты недахоп не самы галоўны. Малекулярна-генетычныя метады ПЦР-дыягностыкі цягнуць за сабой небяспеку кантамінацыі микобактериальных ДНК. Сертыфікацыйныя патрабаванні па гэтай прычыне для ПЦР-лабараторый распрацаваны выключна жорсткія, яны патрабуюць наяўнасці трох ізаляваных памяшканняў. Тэхналогія ПЦР сучасная і вельмі складаная, яе выкарыстанне патрабуе адпаведнай апаратуры і высакакласныя падрыхтаванага персаналу.

бактэрыяскапія

Пры ўстанаўленні дыягназу вынікі ПЦР-даследаванні абавязкова павінны супастаўляцца з астатнімі дадзенымі: клінічнае абследаванне, рэнтгенаграфія, мікраскапія мазка, пасеў і нават адказ на спецыфічнае лячэнне тут вельмі важныя. У гэтым шэрагу даследаванняў ПЦР з'яўляецца толькі адным з кампанентаў. Выявіць ўзбуджальнік ў самым пачатку дыягностыкі можна найбольш простымі і хуткімі метадамі - бактэрыялагічнымі.

Тут выкарыстоўваецца светлавы мікраскоп (афарбоўка па Цилю-Нильсену) і люмінесцэнтны (афарбоўка флюорохромами). Перавагай бактэрыяскапіі з'яўляецца шпаркасць атрымання вынікаў. А недахопам яе справядліва лічыцца абмежаванасць магчымасцяў з-за нізкай адчувальнасці. Аднак менавіта гэтаму метаду аддадзена рэкамендацыя СААЗ як найболей эканамічнага і асноўнага для выяўлення хворых на сухоты. Выяўленне мікабактэрый бактэрыялагічных метадам мае значэнне прагнозу, і ацэньваецца бактэрыявыдзяленнем колькасна. Значна больш упэўнена з гэтым спраўляюцца малекулярна-генетычныя метады даследавання туберкулёзу.

культуральные даследаванні

Лепшым выяўленнем мікабактэрый прызнаюць культуральные даследавання. Пасеў паталагічнага матэрыялу вырабляецца ў яечныя асяроддзя: Мардоўскага, Фіна II, Левенштейна-Енсэн і таму падобныя. Арыенціровачных паказчыкам развіцця устойлівасці мікабактэрый да прэпаратаў і ўскосным сведчаннем эфектыўнасці з'яўляецца колькасць мікабактэрый або іх калоній у прабірцы, калі ужыты культуральный метад даследавання. Каб павысіць працэнт выдзялення мікабактэрый, пасеў паталагічнага матэрыялу праводзіцца на некалькі асяроддзяў.

Задавальняючы шматлікія культуральные патрэбы, ўзбуджальніка у тым ліку прадастаўляюць і вадкія асяроддзя. Выкарыстоўваюцца пры гэтым і аўтаматызаваныя сістэмы ўліку росту тыпу ВАНТЕС. Пасевы павінны правесці ў інкубацыі да сямі-васьмі тыдняў. Да гэтага часу пасеў з адсутнасцю росту можна лічыць адмоўным. Самым дзейсным спосабам выяўлення мікабактэрый туберкулёзу лічаць біялагічныя пробы: заражаюць дыягнастычным матэрыялам марскіх свінак, якія да сухоты надзвычай адчувальныя.

крыху лічбаў

Найцікавай вобласцю даследавання, якая адкрылася дапамогай ПЦР-дыягностыкі, стала вывучэнне M. tuberculosis - латэнтнай інфекцыі. Сучасная канцэпцыя сухотнай інфекцыі сведчыць аб тым, што са ста чалавек, якія знаходзіліся ў кантакце з M. tuberculosis, дзевяноста цалкам могуць інфікаваць, але толькі ў дзесяці з іх актыўная хвароба атрымлівае развіццё. Астатнія маюць процітуберкулезны імунітэт, і таму ў дзевяноста працэнтах выпадкаў інфекцыя застанецца латэнтнай. Выявіць такую заканамернасць дапамог менавіта малекулярна-генетычны метад.

Генетыкі сцвярджаюць, што пяцьдзесят пяць працэнтаў асоб, у якіх пасевы паталагічнага матэрыялу былі адмоўныя, і восемдзесят працэнтаў асоб, заражаных M. tuberculosis, але з якая працякае без якіх-небудзь рэнтгенаграфічных праяў хваробай, адказы ПЦР атрымалі станоўчыя. Менавіта генетычны метад дыягностыкі дапамог выявіць хворых з груп рызыкі з дапамогай ПЦР-даследаванняў, прычым вынікі іх аналізаў (мікраскапія і пасевы) былі адмоўнымі, а Субклінічны інфекцыя M. tuberculosis прысутнічала.

сучасныя даследаванні

Бактэрыялагічныя лабараторыі Расійскай Федэрацыі выкарыстоўваюць і паскораны метад абсалютных канцэнтрацый: тэстуецца нитратредуктазная актыўнасць мікабактэрый пасродкам рэактыва Грисса. Процітуберкулезны цэнтры карыстаюцца метадам, які дазваляе вызначыць лекавую ўстойлівасць. Гэта пасеў у вадкія асяроддзя, дзе аўтаматызавана радыеметрычных і флюоресцентная сістэма уліку росту мікабактэрый. Такі аналіз робіцца хутка - да двух тыдняў.

У цяперашні час і новыя метады распрацоўваюцца: лекавая ўстойлівасць мікабактэрый ацэньваецца на ўзроўні генатыпу. Вывучэнне малекулярных механізмаў рэзістэнтнасці паказвае наяўнасць генаў і ў мікабактэрый. Гены гэтыя звязаныя з устойлівасцю да пэўных прэпаратаў. Напрыклад, гены kasA, inhA, katG ўстойлівыя да изониазиду, ген rpoB - да рифампицину, гены 16Sp РНК і rpsL - да стрэптаміцын, emb1 - да этамбутолу, gyrA - да фторхінолонов і гэтак далей.

мутацыі

У сучаснай дыягностыцы значна павысіўся малекулярна-генетычны ўзровень метаду вывучэння ДНК і дазволіў праводзіць шырокамаштабныя даследаванні мутацый ва ўсім іх спектры. Цяпер мы ведаем, што найбольш распаўсюджаныя мутацыі ў 516, 526 і 531 кодоном гена rpoB, а таксама выяўленыя ўстойлівасці да розных прэпаратаў. Існуе цэлы комплекс метадаў для типирования мікабактэрый з выкарыстаннем не толькі метадаў традыцыйных - біяхімічных, біялагічных і культуральной, але шырока ўжываюцца і сучасныя малекулярна-генетычныя метады. Ужо існуюць адэкватныя і забяспечваюць дакладную дыягностыку методыкі выяўлення моногенных хвароб. Яны грунтуюцца на даследаваннях ДНК ў дакладнай раёне вызначанага гена. Гэта, як правіла, працэс складаны, працаёмкі і дарагі, затое дадзеныя, якія прадастаўляюць метады малекулярна-генетычнага аналізу, значна больш дакладныя і інфарматыўныя, чым дадзеныя ўсіх іншых аналізаў.

Даўно вядома, што ДНК не змяняецца за ўсё жыццё арганізма, што яна ў любы ядзернай клетцы однакова, і гэта дае магчымасць браць на аналіз абсалютна любыя клеткі арганізма, на любых стадыях антагенезу. Пашкоджаны ген можна выявіць да з'яўлення першых сімптомаў, да разгорнутай клінікі захворвання, а таксама ў здаровых гетерозиготных людзей, але якія маюць у гене мутацыю. Малекулярна-генетычныя метады дыягностыкі спадчынных хвароб дазваляюць выявіць яе (прамым падыходам ДНК-дыягностыкі), а таксама прааналізаваць сегрэгацыі захворвання ў сям'і з маркерная локусам ДНК (паліморфны ўчасткамі), якія цесна счэплены з пашкоджаным геном (гэта значыць ўскосным падыходам ДНК-дыягностыкі). Прамая ці ўскосная - любая ДНК-дыягностыка грунтуецца на метадах, якія ідэнтыфікуюць строга пэўны ўчастак ДНК чалавека.

прамыя метады

Прамымі метадамі ДНК-дыягностыкі карыстаюцца ў выпадках, калі ген-віноўнік спадчыннага захворвання вядомы, а таксама вядомыя і тыпы яго мутацый. Напрыклад, мэтазгодныя прамыя метады пры цэлым шэрагу захворванняў. Гэта харэя Гентингтона (пашырэнне CTG-паўтораў), фенілкетанурыя (R408W), мукавісцыдозу (delF508, мажорная мутацыя) і таму падобныя. Галоўным перавагай прамога метаду з'яўляецца стоадсоткавая дакладнасць дыягностыкі, а таксама няма неабходнасці рабіць ДНК-аналіз астатняй сям'і. Калі мутацыя ў адпаведным гене выяўленая, гэта дазваляе цалкам сапраўды зацвердзіць дыягназ спадчыннасці, вызначыць генатып для ўсёй астатняй абцяжараныя сям'і.

Іншым годнасцю прамой дыягностыкі лічыцца выяўленне гетерозиготного носьбіцтва нядобрых мутацый у сваякоў і бацькоў памерлага ад хваробы. Гэта асабліва актуальна для захворванняў аўтасомна-рецессивных. Недахопы ў прамых метадаў таксама маюцца. Каб іх ужыць, трэба дакладна ведаць лакалізацыю паталагічнага гена, Экзон-інтроны яго структуру і спектр яго мутацый. Далёка не ўсе моногенные хваробы сёння атрымалі падобную інфармацыю. Інфарматыўнасць прамых метадаў не можа лічыцца поўнай, паколькі адзін і той жа ген можа мець вялікую колькасць паталагічных мутацый, што і абумоўлівае развіццё спадчынных хвароб.

ускосныя метады

Ускосныя метады ў ДНК-дыягностыцы прымяняюцца зусім у іншых выпадках: калі пашкоджаны ген не ідэнтыфікаваны, а ўсяго толькі лакалізаваны на храмасоме, або калі прамая дыягностыка не дала выніку (гэта бывае, калі ў гена складаная малекулярная арганізацыя ці значная працягласць, калі ў ім шмат паталагічных мутацый). Ўскоснымі метадамі праводзіцца аналіз сегрэгацыі паліморфных маркераў ў сям'і алеляў. Маркеры знаходзяцца ў гэтым жа хромосомном раёне або цесна счэплены з локусом захворвання і ўяўляюць сабой дзялок або инсерции, точковые замены, паўторы, а іх палімарфізм абумоўлены рознай колькасцю ў блоку элементаў.

Самымі зручнымі для ўскоснай дыягностыкі лічацца микросателлитные і минисателлитные паліморфныя маркеры, якія шырока распаўсюджаныя ў геноме чалавека. Каштоўнасць іх выяўляецца ў высокай інфарматыўнасці, калі генетычная адлегласць паміж пашкоджаннем ў гене і маркерам не аказваецца занадта вялікім. У апошнім выпадку дакладнасць ацэнкі вызначаецца ў вялікай ступені частатой рэкамбінацыі паміж паліморфны маркерам і пашкоджаннем. Ускосныя метады дыягностыкі таксама прадугледжваюць абавязковы папярэдні этап даследавання частоты алеляў аналізаваных папуляцый сярод носьбітаў мутацый і хворых, плюс да гэтага неабходнасць вызначэння верагоднасці нераўнавагі і рэкамбінацыі счаплення маркераў і мутантных алеляў гена.

іншыя метады

Кароткія сегменты РНК або ДНК, а таксама асобны ген пры мікраскапічным даследаванні візуалізаваных быць не можа, таму, каб ідэнтыфікаваць мутацыі, неабходныя метады малекулярна-генетычнай дыягностыкі. Існуючы "Праект геному чалавека", як і іншыя дасягненні малекулярнай генетыкі, шмат у чым пашырыў магчымасць дыягностыкі спадчынных захворванняў - як пера-, так і постнатальной. Гэтыя метады могуць забяспечыць ранняе выяўленне і зрабіць прагноз полі- і моногенных хвароб, у якіх дэбют адбываецца ў дарослым узросце. На жаль, па тэхнічных магчымасцях малекулярна-генетычныя даследаванні часам выходзяць за этычныя рамкі, якія ўстаноўлены адносна спадчыннасці, асабліва калі дыягностыка праводзіцца ў падлеткавым і дзіцячым узросце.

Структурныя і колькасныя анамаліі храмасом з'яўляюцца самымі распаўсюджанымі прычынамі і анкалагічных захворванняў, і многіх парокаў развіцця. Храмасомныя аберацыі неабходна ідэнтыфікаваць, што важна для сямейнага кансультавання - даць ацэнку прагнозу нароўні з рэпрадуктыўным рызыкай пры будучых цяжарнасці. Хромосомный аналіз з'яўляецца "залатым стандартам" генетычнай дыягностыкі, але і ў яго магчымасці абмежаваныя. Толькі метады малекулярна-генетычнага аналізу могуць зрабіць большае, таму што там ужываюцца заснаваныя тэхналогіямі кланавання флюарэсцуе пазнакі, здольныя з іх высокай адчувальнасцю выявіць тонкія храмасомныя змены, якія немагчыма выявіць класічным цытагенетычных даследаваннем. Гэтыя тэхнікі ўсё больш пашыраюць нашы дыягнастычныя магчымасці, калі абследуюцца дзеці з заганамі развіцця, з разумовай адсталасцю, з многімі іншымі спадчыннымі захворваннямі.

высновы

Вельмі важнымі для чалавецтва з'явіліся веды структуры і функцый генаў, відаў іх зменлівасці, уменне распазнаваць спадчынныя хваробы, што адбылося ў сувязі з развіццём малекулярнай генетыкі. Метады яе накіраваны на даследаванне малекулы ДНК - і калі яна знаходзіцца ў норме, і пры пашкоджанні яе. Атрыманне паслядоўнасцяў нуклеатыдаў дэзаксірыбануклеінавай кіслаты (ДНК) праходзіць паэтапна ад атрымання узораў да ідэнтыфікацыі асобных фрагментаў. Вылучэнне геномной ДНК з клетак, рэстрыкцыяў (раздзіранне), амплификация (кланаванне), электрафарэз фрагментаў (падзел іх па электрычным зарадзе і малекулярнай масе з дапамогай агарозного геля). Ідэнтыфікацыя пэўных фрагментаў, размешчаных на яго паверхні дыскрэтнай паласой.

Потым у справу ўступаюць спецыяльныя фільтры, з дапамогай якіх праходзіць гібрыдызацыя кожнага фрагмента з кланаваных фрагментамі ДНК або з сінтэтычнымі радыеактыўнымі зондамі, якiя з'яўляюцца кантрольнымі, па якіх і будзе раўняцца кожны доследны фрагмент. Калі змянілася становішча або яго даўжыня параўнальна з зондам, калі з'явіўся новы фрагмент або знік, - усё гэта кажа пра тое, што доследны ген падвергнуўся перабудове ў паслядоўнасці нуклеатыдаў. Існуе восем асноўных метадаў малекулярна-генетычнага даследавання: секвенирование (вызначэнне паслядоўнасці ДНК), палімеразную ланцуговая рэакцыя (павелічэнне колькасці паслядоўнасцяў), атрыманне праймер вядомых генаў, кланаванне ДНК, атрыманне рэкамбінантныя малекул, атрыманне бялкоў за кошт рэкамбінантныя малекул, стварэнне поўнага набору (калекцыі, бібліятэкі) кланаваных фрагментаў, якія атрымаліся з дапамогай рэстрыкцыі.