Флуоресцентная мікраскапія: прынцыпы метаду

Паглынанне і далейшае переизлучение святла неарганічнымі і арганічнымі асяроддзямі з'яўляецца вынікам фасфарэсцэнцыі або флуарэсцэнцыі. Розніца паміж феноменамі складаецца ў працягласці інтэрвалу паміж светлавым паглынаннем і выпусканнем патоку. Пры флуарэсцэнцыі гэтыя працэсы адбываюцца практычна адначасова, а пры фасфарэсцэнцыі - з некаторым спазненнем.

Гістарычная даведка

У 1852 г. брытанскі навуковец Стокс ўпершыню апісаў флуарэсцэнцыю. Ён увёў новы тэрмін у выніку выкананых эксперыментаў з плавікавай шпат, які крычаў чырвонае святло пад уздзеяннем ультрафіялету. Стокс адзначыў цікавае з'ява. Ён выявіў, што даўжыня хвалі пры флуоресцентные выпраменьванні заўсёды больш, чым у патоку святла ўзбуджэння.

Для пацверджання гіпотэзы ў 19-м стагоддзі было праведзена мноства эксперыментаў. Яны паказалі, што разнастайныя ўзоры флуоресцируют пад дзеяннем ультрафіялету. Сярод матэрыялаў, у ліку іншага, былі крышталі, смалы, мінералы, хларафіл, лекавае сыравіну, неарганічныя злучэнні, вітаміны, масла. Непасрэднае ж прымяненне фарбавальнікаў для правядзення біялагічных аналізаў пачалося толькі ў 1930 г.

Флуоресцентная мікраскапія: апісанне

Некаторыя з матэрыялаў, выкарыстаных у даследаваннях першай паловы 20-га стагоддзя, валодалі высокай спецыфічнасцю. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Дзякуючы паказчыках, якія не маглі быць дасягнутыя кантраснымі спосабамі, метад флуоресцентной мікраскапіі стаў найважнейшым інструментам і ў біямедыцынскіх, і ў біялагічных даследаваннях. Немалаважнае значэнне атрыманыя вынікі мелі і для матэрыялазнаўства.

? Якія перавагі мае метад флуоресцентной мікраскапіі? З дапамогай новых матэрыялаў стала магчымым вылучэнне высокоспецифичных клетак і субмикроскопических кампанентаў. Флуоресцентный мікраскоп дазваляе выявіць асобныя малекулы. Разнастайныя фарбавальнікі дазваляюць ідэнтыфікаваць некалькі элементаў адначасова. Нягледзячы на абмежаванасць прасторавага дазволу абсталявання дыфракцыйную мяжою, які, у сваю чаргу, залежыць ад спецыфічных уласцівасцяў ўзору, выяўленне малекул ніжэй за гэты ўзровень таксама цалкам магчыма. Розныя ўзоры пасля апрамянення праяўляюць автофлуоресценцию. Гэта з'ява досыць шырока ўжываецца ў петрологии, батаніцы, паўправадніковай прамысловасці.

асаблівасці

Вывучэнне жывёл тканін небудзь патагенных мікраарганізмаў часцяком ўскладняецца або занадта слабой, або вельмі моцнай неспецифичной автофлуоресценцией. Аднак значэнне ў даследаваннях набывае ўнясенне ў матэрыял кампанентаў, якія ўзбуджаюцца на канкрэтнай даўжыні хвалі і выпускалы светлавы струмень неабходнай інтэнсіўнасці. Флуорохромы выступаюць у якасці фарбавальнікаў, здольных самастойна прымацоўвацца да структураў (нябачным або бачным). Пры гэтым яны адрозніваюцца высокай выбіральнасцю адносна мішэняў і квантавым выхадам.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Флуоресцентная мікраскапія стала шырока прымяняцца з з'яўленнем натуральных і сінтэтычных фарбавальнікаў. Яны валодалі пэўнымі профілямі інтэнсіўнасці выпускання і ўзбуджэння і былі накіраваны на канкрэтныя біялагічныя мішэні.

Выяўленне асобных малекул

Часта ў ідэальных умовах можна зарэгістраваць свячэнне асобнага элемента. Для гэтага, акрамя іншага, трэба забяспечыць дастаткова нізкі шум дэтэктара і аптычны фон. Малекула флуоресцеина да разбурэння з прычыны фотообесцвечивания можа выпускаць да 300 тыс. Фатонаў. Пры 20% збіральнасці і эфектыўнасці працэсу іх можна зарэгістраваць у колькасці каля 60 тыс.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Флуоресцентная мікраскапія, заснаваная на лавіну фотадыёд або электронным памнажэньні, дазваляла даследчыкам назіраць паводзіны асобных малекул на працягу секунд, а ў шэрагу выпадкаў і хвілін.

складанасці

Ключавой праблемай выступае падаўленне шуму ад аптычнага фону. У сувязі з тым, што многія з матэрыялаў, якія выкарыстоўваюцца ў канструкцыі фільтраў і лінзаў, праяўляюць некаторую автофлуоресценцию, намаганні навукоўцаў на пачатковых этапах былі арыентаваны на выпуск кампанентаў, якія валодаюць малой флуарэсцэнцыі. Аднак наступныя эксперыменты прывялі да новых высноў. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. У прыватнасці, было ўстаноўлена, што флуоресцентная мікраскапія, заснаваная на поўным ўнутраным адлюстраванні, дазваляе дасягнуць нізкага фону і высокаінтэнсіўнага узбуджальнага светлавога патоку.

механізм

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Прынцыпы флуоресцентной мікраскапіі, заснаванай на поўным ўнутраным адлюстраванні, заключаюцца ў выкарыстанні быстрозатухающей або нераспространяющейся хвалі. Яна ўзнікае на мяжы асяроддзяў з рознымі паказчыкамі праламлення. У дадзеным выпадку светлавы пучок праходзіць скрозь прызму. Яна валодае высокім параметрам праламлення.

Прызма прылягае да воднага раствору або шкле з нізкім параметрам. Калі струмень святла накіроўваецца на яе пад вуглом, які больш крытычнага, пучок цалкам адлюстроўваецца ад мяжы падзелу. Гэта з'ява, у сваю чаргу, выклікае нераспространяющуюся хвалю. Іншымі словамі, генеруецца электрамагнітнае поле, пранікальнае ў сераду з меншым параметрам праламлення на адлегласць менш 200 нанаметраў.

У нераспространяющейся хвалі інтэнсіўнасць святла будзе цалкам дастатковай для ўзбуджэння флуорофоров. Аднак з прычыны яе выключна нязначнай глыбіні яго аб'ём будзе вельмі малым. У выніку ўзнікае нізкаўзроўневы фон.

мадыфікацыя

Флуоресцентная мікраскапія, заснаваная на поўным ўнутраным адлюстраванні, можа рэалізоўвацца з дапамогай эпідэ-асвятлення. Для гэтага неабходныя аб'ектывы з падвышанай лікавы Апертура (як мінімум 1.4, аднак пажадана, каб яна дасягала 1.45-1.6), а таксама часткова асветленае поле апарата. Апошняе дасягаецца з дапамогай плямы невялікага памеру. Для большай раўнамернасці выкарыстоўваецца тонкае кольца, з дапамогай якога блакуецца частка патоку. Для атрымання крытычнага кута, пасля якога ўзнікае поўнае адлюстраванне, патрэбен высокі ўзровень праламлення иммерсионной асяроддзя ў лінзах і покрыўнага шкла мікраскопа.